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案例 | JMP定制实验设计优化胃癌患者PBMC分离方案的研究

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发表于 2019-11-6 15:00:17 | 显示全部楼层 |阅读模式
胃癌是癌症死亡的常见原因,在我国的发病率居高不下,严重威胁人民健康(郑莹和吴春晓, 2016)。外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)与胃癌的生存预后密切相关(Tsai et al., 2013),PBMC具有免疫功能(吕秋菊等, 2015)、具有显著的临床和生物学研究价值(Kim et al., 2016),广泛应用于肿瘤治疗研究(Koeck et al., 2016)。但是自外周静脉血分离PBMC的条件暂无统一意见(Moreli et al., 2016; Corkum et al., 2015; 代光明等, 2014),亟待深入研究。

基于JMP软件的实验设计,在有效控制误差的前提下,用较少的实验次数,获得可靠的结果,已被广泛应用(吴繁等, 2016)。本研究采用JMP软件的定制设计PBMC的分离条件,优化离心时间及速度,为胃癌患者PBMC的分离优化、基础以及临床研究提供依据。

本文作者安徽医科大学第一附属医院胃肠外科汪圣毅等,经作者授权发布。

材料与方法

本实验用静脉血采集自安徽医科大学第一附属医院胃肠外科的胃癌患者。

研究淋巴细胞分离液分离胃癌患者外周静脉血PBMC的效率,观察离心时间(X1)、离心速度(X2)对离心后PBMC分离层厚度(Y)的影响。综合预实验及文献结果,确定离心时间的范围为10~30min,离心速度的范围为1000~3000r/min。PBMC分离层厚度作为响应变量,目标设置为最大化。模型中选择二次交互作用及二次幂。定义因子约束:1X1+1X2≤3025,1X1+1X2≥1020,定制设计PBMC分离条件,X1、X2遇小数时四舍五入取整数,共12次实验(下表)。


PBMC分离方法

含EDTA抗凝管采集患者外周静脉血4ml,15ml离心管中距Ficoll液面1cm处沿管壁缓慢加血液至Ficoll液面上。20℃温度下按照定制设计结果的参数进行离心,离心后从管底至液面分四层,依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。

PBMC离心厚度测定

分离后的离心管用胶布固定于垂直墙面,固定数码相机于PBMC云雾层水平高度,调整焦距拍摄照片。照片置入Photoshop CS软件,测量云雾层厚度:同一试管图片中100mm刻度的物理长度作为参照,标尺工具测量其像素长度,信息面板读取数据并记录,相同方法测量PBMC厚度(像素长度),按照以下公式计算PBMC云雾层的物理长度(待测厚度):


PBMC活力测定


根据JMP软件分析得出最佳优化条件,离心分离PBMC,移液管插入云雾层,轻轻吸出云雾层,置入新的离心管中,加入3倍PBMC体积的PBS,20℃,2000r,10min,洗涤两次,弃上清。加500ul PBS稀释,制备单细胞悬液。移液器吸取450ul上述悬液至EP管,加50ul台盼蓝溶液,细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液9:1混合、混匀(终浓度0.04%)。3min内拍照,PS软件手工标记、计数活细胞及死细胞。镜下观察,死细胞被染成蓝色,活细胞拒染呈无色透明状。计算细胞存活率:细胞存活率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数) X 100%。

JMP软件对定制设计结果数据进行分析,采用标准最小二乘法分析离心时间、离心速度的主效应、二次效应、交互作用,P<0.05为差异具有统计学意义。




结果与分析

PBMC的厚度测量结果

利用JMP定制设计得到12次实验,根据每次实验中的具体离心时间、离心速度参数,进行离心,离心后拍照,Photoshop软件测量离心管中PBMC的厚度,结果见表1。表1 不同离心条件下PBMC厚度测量结果


离心时间、离心速度对PBMC厚度的影响

利用JMP软件拟合模型,采用标准最小二乘法进行效应筛选,离心时间及速度两个因素的主效应、二次效应、交互作用对PBMC厚度的影响(表2)。

表2 离心分离因素对PBMC厚度的影响

离心时间、离心速度及其交互作用对PBMC厚度的影响均具有统计学意义,P<0.05;时间与速度的交互作用无统计学意义(P>0.05)。对各参数估计值软件排序(表3),离心时间的影响大于离心速度。

表3 排序后的参数估计值

模型拟合情况

标准最小二乘法拟合模型的方差分析(表4),模型和误差的均方分别为0.191981、0.021543,F值为8.911,模型的P<0.01,表明拟合模型在α=0.01的水平上是显著的。

表4 定制实验设计模型的方差分析

该拟合模型中预测值与实际值的关系(图1)可见:决定系数R2=0.88,表明该模型可以解释88%的变异,模型拟合较好。

图1 预测值与实际值的关系

曲面图刻画
根据标准最小二乘法拟合模型,利用JMP软件进行因子刻画(曲面刻画器),将具有响应变量的模型显示为曲面,得到曲面图(图2)。可以直观地找到响应变量即PBMC厚度的最大值,并且可以观察离心时间及离心速度之间的交互作用。

图2 离心时间与速度交互影响PBMC厚度的曲面图

预测刻画器最优设置

JMP软件预测刻画器中选择最大化意愿,软件自动调整预测刻画图形,得到PBMC厚度为最大值的最优设置(图3)发现:密度梯度离心法分离胃癌患者外周血PBMC,获取PBMC最大厚度的方法是:离心时间使用10min,离心速度定为2306.962r/min,约为2307r/min。本实验预测,在上述条件下,PBMC厚度理论值为2.596923mm,95%CI(2.34213, 2.85171)。

图3 预测刻画器最大化意愿的设置

优化条件下的细胞活力测定

离心时间=10min,离心速度=2307r/min,离心所得PBMC进行台盼蓝染色(图4)。细胞总数为199个,死细胞总数为8个,细胞存活率为95%。

图4 PBMC台盼蓝染色(×10)





讨论

密度梯度离心被广泛应用于PBMC的分离(赵杰等,2014),但不同单位、不同研究人员采用不同的离心时间、离心速度分离PBMC,分离效果文献报告较少(Huang et al., 2014; Saidijam et al., 2014),缺乏标准操作程序和指南,导致实验结果缺乏一致性、可比性,部分离心分离效率较低,影响后续实验地进行。

本研究使用JMP软件进行定制设计,以PBMC离心厚度作为响应变量,离心时间、离心速度作为因子变量,获取12次实验,离心分离的PBMC厚度采用Photoshop CS6.0测量,经标准最小二乘法分析发现:离心时间、离心速度的主效应及其二次效应均对PBMC厚度产生影响;离心时间与离心速度的交互作用无统计学意义。

建立模型的决定系数R2=0.88,可以解释88%的响应变异。预测的PBMC厚度与实际值一致性较好。预测刻画得到的最优分离条件:离心时间=10min,离心速度=2307r/min,预测的PBMC厚度=2.596923mm,95%CI(2.34213, 2.85171),实际厚度=2.7mm,台盼蓝染色发现细胞存活率=95%。

离心时间、离心速度的二次效应在实验操作过程中不具有实际意义。本研究发现的最优条件与蔡敏敏等人的报告(蔡敏敏等,2016)不一致,主要原因有:
  • 设计方案不同,蔡敏敏等仅仅采用分组实验设计,本研究采用JMP软件实施定制实验设计,该设计方法基于数学模型,统计结果更具科学性、先进性(史智佳等, 2010);
  • 研究对象存在一定的差异;
  • 其他实验条件如温度可能存在一定的差异;
  • 实验设备如离心机品牌差异。

预测刻画器分析发现:离心时间、离心速度的主效应与响应变量PBMC厚度之间均呈现曲线关系,随着离心时间的延长,PBMC厚度先降低、再升高,随着离心速度的增加,PBMC厚度先增加、再减少,表明因子变量即离心时间和速度对PBMC厚度的影响是复杂的,并不是简单的线性相关关系,值得在实验过程中引起注意。

本研究利用因子刻画器模拟计算的最佳离心时间、离心速度进行验证,发现PBMC实际厚度落在预测厚度范围内,表明模型拟合较好。台盼蓝染色表明:最优条件下离心所得细胞的存活率较高,可以用于后续的实验研究。本研究为胃癌患者外周血PBMC离心条件的优化研究提供了新的方法。

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